CD73 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400307-ACT

NT5E codifica CD73 (ecto-5′-nucleotidasi), un ectoenzima ancorato tramite GPI che idrolizza l’AMP extracellulare in adenosina e fosfato inorganico, contribuendo a modellare la segnalazione purinergica nel microambiente tissutale. Controllando la disponibilità locale di adenosina, CD73 modula le vie dei GPCR associate al cAMP e influenza l’attivazione delle cellule immunitarie, la permeabilità vascolare e le interazioni piastrine–endotelio. L’attività di CD73 contribuisce alla regolazione dell’infiammazione e delle risposte associate all’ipossia ed è ampiamente utilizzata come marcatore degli stati delle cellule stromali ed endoteliali. Un’espressione o una funzione deregolata di NT5E/CD73 è stata associata a un’alterata regolazione immunitaria e a un rimodellamento tissutale aberrante in molteplici contesti rilevanti per la malattia.

CD73 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NT5E senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD73 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NT5E nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NT5E, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD73. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NT5E nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD73 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD73 nelle cellule tumorali con espressione di NT5E silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.