CD28 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401525-ACT

Il CD28 umano codifica un recettore costimolatorio espresso sulle cellule T che si lega ai ligandi della famiglia B7 (CD80/CD86) per amplificare la segnalazione del recettore delle cellule T e sostenere una piena attivazione. L’ingaggio di CD28 promuove la produzione di IL-2, la sopravvivenza e la riprogrammazione metabolica attraverso le vie PI3K–AKT–mTOR, NF-κB e MAPK, influenzando proliferazione, differenziamento e output citochinico. Una segnalazione di CD28 deregolata è implicata in patologie immuno-mediate e nell’elusione immunitaria da parte dei tumori, e alterazioni dell’espressione o della segnalazione possono influenzare le risposte in modelli di autoimmunità, infezione cronica e immunologia del cancro. CD28 è quindi un nodo chiave per studiare le soglie di attivazione delle cellule T, le interazioni con i checkpoint e la dinamica del microambiente immunitario.

CD28 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CD28 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD28 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CD28 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CD28, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD28. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CD28 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD28 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD28 nelle cellule tumorali con espressione di CD28 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.