CCK-BR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401867-ACT

Il gene umano **CCKBR** codifica il recettore della colecistochinina B (CCK-BR), un GPCR di classe A attivato dai peptidi gastrina e colecistochinina, che si accoppia principalmente a **Gq/11** per stimolare la fosfolipasi C, la segnalazione **IP3/DAG**, i flussi intracellulari di **Ca2+** e programmi trascrizionali dipendenti da **PKC**. Gli effetti a valle includono la modulazione della segnalazione **MAPK/ERK**, della dinamica del citoscheletro e di risposte secretorie e proliferative in contesti gastrointestinali e neuronali. L’attività di CCKBR integra segnali neuroendocrini con l’omeostasi epiteliale e l’eccitabilità, e una segnalazione o un’espressione recettoriale deregolate sono state studiate in relazione a segnali di crescita aberranti e al rimodellamento associato all’infiammazione. In quanto recettore di membrana con una farmacologia ligando–recettore ben definita, CCK-BR è anche utilizzato per studiare la desensibilizzazione dei GPCR, il trafficking e il bias delle vie di secondi messaggeri.

CCK-BR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCKBR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CCK-BR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCKBR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCKBR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CCK-BR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCKBR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CCK-BR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CCK-BR nelle cellule tumorali con espressione di CCKBR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.