CCK-AR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402419-ACT

Il gene umano **CCKAR** codifica il recettore della colecistochinina A (CCK-AR), un GPCR di classe A attivato da peptidi della colecistochinina che regola la segnalazione associata alla digestione e i segnali di sazietà indotti dai nutrienti. In seguito al legame con il ligando, CCK-AR attiva vie mediate da proteine G che modulano il calcio intracellulare e le cascate di chinasi a valle, coordinando le risposte secretorie e la contrattilità della muscolatura liscia nei tessuti gastrointestinali. L’attività di CCKAR si integra con la comunicazione neuroendocrina tra intestino e cervello e influenza programmi cellulari legati al metabolismo e all’equilibrio energetico. Una segnalazione di CCKAR deregolata è stata studiata nel contesto di fenotipi metabolici e alterazioni funzionali gastrointestinali, a supporto della sua rilevanza per studi meccanicistici della trasduzione del segnale mediata da recettori.

CCK-AR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCKAR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CCK-AR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCKAR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCKAR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CCK-AR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCKAR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CCK-AR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CCK-AR nelle cellule tumorali con espressione di CCKAR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.