CCK-4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-427959-ACT

Il gene Ptk7 del topo codifica la protein tirosina chinasi 7 (nota anche come CCK-4), un recettore atipico nella rete Wnt/polarità planare cellulare (PCP) che contribuisce a coordinare la migrazione cellulare direzionale, la polarità tissutale e i movimenti morfogenetici. PTK7 modula la segnalazione Wnt non canonica attraverso interazioni con i componenti principali della PCP, influenzando il rimodellamento del citoscheletro, l’adesione cellulare e il comportamento collettivo delle cellule durante lo sviluppo. Un’alterazione dell’espressione o della segnalazione di PTK7 è stata associata, in modelli di cancro, a fenotipi modificati legati a invasione e metastasi e, in studi genetici, a difetti dello sviluppo del tubo neurale e cardiovascolare. In quanto regolatore della segnalazione associato alla superficie cellulare, PTK7 è spesso utilizzato per studiare il crosstalk tra la via Wnt/PCP, la segnalazione recettoriale e i programmi trascrizionali dipendenti dalla polarità.

CCK-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ptk7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CCK-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ptk7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ptk7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CCK-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ptk7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CCK-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CCK-4 nelle cellule tumorali con espressione di Ptk7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.