CCDC109A Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-413850-LAC

MCU (CCDC109A) codifica la subunità che forma il poro dell’uniporto mitocondriale del calcio, un determinante chiave dell’ingresso di Ca²⁺ nei mitocondri attraverso la membrana interna. Collegando i segnali citosolici di Ca²⁺ ai livelli di Ca²⁺ nella matrice, MCU regola la fosforilazione ossidativa, l’attività degli enzimi del ciclo degli acidi tricarbossilici e la produzione di specie reattive dell’ossigeno, modellando così la bioenergetica cellulare e le risposte allo stress. Il flusso di Ca²⁺ dipendente da MCU influenza anche la transizione di permeabilità mitocondriale, l’apoptosi e programmi trascrizionali regolati dal Ca²⁺ legati al metabolismo e all’infiammazione. Un’attività di MCU deregolata è stata associata ad alterazioni della funzione mitocondriale in contesti quali neurodegenerazione, danno da ischemia-riperfusione, cardiomiopatia e rimodellamento metabolico correlato al cancro, rendendolo un bersaglio frequente negli studi di segnalazione mitocondriale.

Le particelle di attivazione lentivirale CCDC109A (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di MCU in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale CCDC109A (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione MCU, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di CCDC109A. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo MCU e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.