CBS Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419496-ACT

Il gene murino Cbs codifica la cistationina β-sintasi (CBS), un enzima dipendente dal fosfato di piridossale che catalizza, nella via della transulfurazione, la condensazione di omocisteina e serina per formare cistationina. Regolando il flusso dell’omocisteina verso la biosintesi di cisteina e glutatione, la CBS influenza l’equilibrio redox cellulare, la capacità di metilazione e l’omeostasi degli amminoacidi solforati, con effetti a valle sullo stress ossidativo e sulla funzione mitocondriale. La CBS contribuisce inoltre alla produzione endogena di solfuro di idrogeno (H2S), collegando l’attività di Cbs a processi di segnalazione che modulano il tono vascolare e le risposte infiammatorie. La disregolazione del metabolismo dipendente da CBS è ampiamente utilizzata per modellare la fisiopatologia associata all’iperomocisteinemia e per analizzare i contributi metabolici a fenotipi neurovascolari ed epatici nei sistemi murini.

CBS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cbs senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CBS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cbs nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cbs, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CBS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cbs nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CBS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CBS nelle cellule tumorali con espressione di Cbs silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.