Cbp Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401415-ACT

PAG1 codifica a proteína de ligação à Csk (Cbp/PAG1), um adaptador transmembrana concentrado em lipid rafts que funciona como plataforma para complexos de sinalização, restringindo a atividade das quinases da família Src por meio do recrutamento de Csk. Ao organizar sítios de ancoragem fosforilados, a Cbp modula a sinalização proximal dos receptores de células T (TCR) e de células B (BCR), influencia o fluxo das vias MAPK e PI3K a jusante e define limiares de ativação dependentes de receptor. Alterações na expressão ou na fosforilação de PAG1 têm sido associadas à desregulação da sinalização imune, proliferação aberrante e mudanças na adesão e migração celulares, tornando-o relevante para estudos de sinalização inflamatória e de redes oncogênicas de quinases. Em células humanas, a Cbp atua como um nó-chave que conecta a organização de microdomínios de membrana a um controle do tipo checkpoint da sinalização por tirosina-quinases.

Cbp O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PAG1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cbp O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PAG1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PAG1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cbp. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PAG1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cbp no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cbp em células tumorais com expressão de PAG1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.