Cbp Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401415-ACT

PAG1 codifica per la Csk-binding protein (Cbp/PAG1), un adattatore transmembrana concentrato nei lipid raft che funge da piattaforma per complessi di segnalazione, limitando l’attività delle chinasi della famiglia Src tramite il reclutamento di Csk. Organizzando siti di docking fosforilati, Cbp modula la segnalazione prossimale del recettore delle cellule T (TCR) e del recettore delle cellule B (BCR), influenza il flusso a valle delle vie MAPK e PI3K e contribuisce a definire le soglie di attivazione guidate dai recettori. Alterazioni dell’espressione o della fosforilazione di PAG1 sono state associate a segnalazione immunitaria deregolata, proliferazione aberrante e modifiche dell’adesione e della migrazione cellulare, rendendolo rilevante per studi sulla segnalazione infiammatoria e sulle reti oncogeniche di chinasi. Nelle cellule umane, Cbp rappresenta un nodo chiave che collega l’organizzazione dei microdomini di membrana a un controllo di tipo “checkpoint” della segnalazione tirosin-chinasica.

Cbp Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PAG1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cbp Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PAG1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PAG1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cbp. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PAG1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cbp nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cbp nelle cellule tumorali con espressione di PAG1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.