CASPR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402760-ACT

CNTNAP1 codifica la proteina 1 associata alla contactina (CASPR), una molecola di adesione cellulare della superfamiglia delle neurexine, concentrata nelle giunzioni paranodali degli assoni mielinizzati. CASPR coordina le interazioni assone–glia organizzando giunzioni simili alle septate e promuovendo la corretta localizzazione dei canali ionici necessari per un’efficiente conduzione saltatoria. Attraverso i suoi domini extracellulari di adesione e le interazioni intracellulari con proteine di impalcatura, CASPR contribuisce all’assemblaggio e al mantenimento dell’architettura dei nodi di Ranvier e, più in generale, dell’integrità dei circuiti neuronali. L’alterazione della funzione di CNTNAP1 è stata associata a gravi fenotipi neurosviluppativi e a neuropatie periferiche, rendendolo un bersaglio rilevante per lo studio della biologia della mielinizzazione e dell’organizzazione dei domini assonali.

CASPR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CNTNAP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CASPR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CNTNAP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CNTNAP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CASPR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CNTNAP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CASPR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CASPR nelle cellule tumorali con espressione di CNTNAP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.