caspase-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400049-ACT

CASP3 codifica la caspasi-3, una proteasi esecutrice chiave dell’apoptosi che viene attivata a valle delle cascate di segnalazione intrinseca (mitocondriale) ed estrinseca (recettori della morte). Una volta processata dalle caspasi iniziatrici come la caspasi-8 e la caspasi-9, la caspasi-3 scinde numerosi substrati per coordinare la frammentazione del DNA, il rimodellamento del citoscheletro e lo smantellamento irreversibile della cellula. La sua attività si integra con vie di risposta allo stress, inclusa la segnalazione di p53, ed è regolata dalle proteine della famiglia BCL-2 e dagli IAP, collegando la competenza apoptotica alle decisioni sul destino cellulare. La deregolazione della segnalazione di CASP3 è spesso studiata in biologia del cancro, nella neurodegenerazione e in contesti infiammatori, in cui soglie apoptotiche alterate contribuiscono alla sopravvivenza o alla perdita di cellule associate alla malattia.

caspase-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CASP3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

caspase-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CASP3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CASP3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di caspase-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CASP3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da caspase-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via caspase-3 nelle cellule tumorali con espressione di CASP3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.