casein kinase Iδ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401839-ACT

CSNK1D codifica la caseina chinasi Iδ (CK1δ) umana, una protein-chinasi serina/treonina che fosforila numerosi substrati per coordinare la tempistica dell’orologio circadiano, la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno al DNA e il traffico vescicolare. CK1δ contribuisce a reti di trasduzione del segnale, incluse le vie Wnt/β-catenina e Hedgehog, attraverso un controllo dipendente dalla fosforilazione della stabilità, della localizzazione e del turnover dei substrati. Modulando la fosforilazione di proteine dell’orologio e del signaling, CSNK1D influenza i ritmi trascrizionali e la proteostasi, processi spesso alterati nei disturbi proliferativi e neurobiologici. Un’attività deregolata di CK1δ è stata collegata a fenotipi circadiani modificati e a output di segnalazione aberranti che si intersecano con vie oncogeniche e associate alla neurodegenerazione.

casein kinase Iδ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CSNK1D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

casein kinase Iδ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CSNK1D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CSNK1D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di casein kinase Iδ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CSNK1D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da casein kinase Iδ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via casein kinase Iδ nelle cellule tumorali con espressione di CSNK1D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.