calsequestrin 2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419472-ACT

Il gene Casq2 del topo codifica la calsequestrina 2, una proteina luminale del reticolo sarcoplasmatico ad alta capacità di legare Ca2+, che tampona e organizza le riserve di Ca2+ per sostenere l’accoppiamento eccitazione–contrazione. Modellando il comportamento del canale del recettore della rianodina (RYR2) e la cinetica del rilascio di Ca2+ indotto da Ca2+, CASQ2 influenza il cycling del Ca2+, la refrattarietà del reticolo sarcoplasmatico (SR) e la stabilità contrattile dei miociti. L’alterazione dell’omeostasi del Ca2+ dipendente da CASQ2 è associata a meccanismi aritmogenici evocati dallo stress e a programmi di segnalazione intracellulare del Ca2+ modificati, rendendo Casq2 un nodo chiave nella ricerca sull’elettrofisiologia cardiaca e sulla gestione del calcio. Nei sistemi modello, la modulazione di Casq2 è comunemente utilizzata per indagare il buffering del Ca2+ nel SR, la dinamica delle scintille di Ca2+ (Ca2+ sparks) e le risposte di segnalazione a valle a flussi di Ca2+ perturbati.

calsequestrin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Casq2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

calsequestrin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Casq2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Casq2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di calsequestrin 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Casq2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da calsequestrin 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via calsequestrin 2 nelle cellule tumorali con espressione di Casq2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.