calsequestrin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419471-ACT

Il gene murino Casq1 codifica la calsequestrina 1, una proteina luminale del reticolo sarcoplasmatico ad alta capacità di legame del Ca²⁺, che tampona il Ca²⁺ e contribuisce a modulare l’accoppiamento eccitazione–contrazione nel muscolo scheletrico a contrazione rapida. Organizzando l’immagazzinamento e il rilascio di Ca²⁺ in sinergia con la segnalazione del recettore della rianodina e con i meccanismi di gestione degli ioni del reticolo sarcoplasmatico, CASQ1 contribuisce all’omeostasi del calcio, alla performance contrattile e all’adattamento dipendente dall’attività. Alterazioni della funzione o dell’espressione di CASQ1 sono associate a una disregolazione della dinamica intracellulare del Ca²⁺, a una maggiore suscettibilità a danno delle miofibre indotto da stress e a fenotipi fisiologici muscolari rilevanti per studi su miopatie e risposte simili all’ipertermia maligna. Casq1 rappresenta quindi uno strumento utile per indagare il buffering del Ca²⁺ nel reticolo sarcoplasmatico, la segnalazione Ca²⁺-dipendente e i meccanismi di malattia del muscolo scheletrico in modelli murini e in sistemi cellulari ingegnerizzati.

calsequestrin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Casq1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

calsequestrin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Casq1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Casq1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di calsequestrin 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Casq1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da calsequestrin 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via calsequestrin 1 nelle cellule tumorali con espressione di Casq1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.