Calponin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419719-ACT

Il gene murino Cnn1 codifica la calponina 1, una proteina legante l’actina arricchita nel muscolo liscio differenziato, dove modula il comportamento contrattile regolando le interazioni actina–miosina e l’organizzazione del citoscheletro. La calponina 1 partecipa al controllo calcio‑dipendente della dinamica actomiosinica ed è associata alla segnalazione RhoA/ROCK, al rimodellamento delle adesioni focali e al cambio fenotipico tra stati contrattili e sintetici del muscolo liscio. Le variazioni dell’espressione di CNN1 vengono utilizzate come indicatori del differenziamento del muscolo liscio e del rimodellamento vascolare, con rilevanza per processi quali l’iperplasia intimale/neointimale, i programmi di miofibroblasti associati alla fibrosi e le alterazioni della biomeccanica tissutale. In quanto regolatore del citoscheletro, la calponina 1 rappresenta un nodo funzionale per studiare meccanotrasduzione, migrazione e segnalazione guidata dalla matrice extracellulare in modelli di muscolo liscio vascolare e delle vie aeree.

Calponin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cnn1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Calponin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cnn1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cnn1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Calponin 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cnn1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Calponin 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Calponin 1 nelle cellule tumorali con espressione di Cnn1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.