Calpain 10 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423852-ACT

Capn10 codifica la calpaina 10, una proteasi cisteinica calcio-dipendente non lisosomiale che modula una proteolisi limitata di substrati intracellulari per regolare il turnover proteico, il rimodellamento del citoscheletro e la trasduzione del segnale. Nelle cellule murine, l’attività della calpaina 10 è stata collegata alla funzione mitocondriale, alle risposte allo stress ossidativo e all’omeostasi metabolica, influenzando vie che coordinano la segnalazione dell’insulina e l’utilizzo del glucosio. Un’espressione o un’attività deregolata di CAPN10 è stata associata a fenotipi metabolici, tra cui alterazioni della sensibilità all’insulina e dell’equilibrio energetico, a sostegno della sua rilevanza negli studi sui meccanismi legati al diabete. In quanto proteasi in grado di rimodellare le reti di segnalazione tramite eventi di clivaggio mirati, la calpaina 10 è spesso esaminata in contesti quali la biologia degli adipociti, il metabolismo del muscolo scheletrico e il rimodellamento indotto da stress.

Calpain 10 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Capn10 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Calpain 10 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Capn10 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Capn10, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Calpain 10. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Capn10 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Calpain 10 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Calpain 10 nelle cellule tumorali con espressione di Capn10 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.