Calpain 10 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405032-ACT

CAPN10 codifica la calpaina 10, una proteasi cisteinica calcio-dipendente espressa in modo ubiquitario, che modula una proteolisi limitata di substrati intracellulari per regolare il turnover proteico, il rimodellamento del citoscheletro e la trasduzione del segnale. L’attività della calpaina 10 influenza l’omeostasi mitocondriale, il metabolismo di glucosio e lipidi e le vie di risposta allo stress attraverso il controllo proteolitico di proteine chiave metaboliche e di segnalazione. La variabilità genetica e l’alterata espressione di CAPN10 sono state associate a fenotipi metabolici, inclusi insulino-resistenza e suscettibilità al diabete di tipo 2, a sostegno della sua rilevanza negli studi sulla disfunzione endocrina e mitocondriale. Nella ricerca biomedica, CAPN10 viene spesso studiato per i suoi ruoli nell’energetica cellulare, nel rimodellamento metabolico legato all’infiammazione e nella regolazione tessuto-specifica delle reti di proteasi.

Calpain 10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CAPN10 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Calpain 10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CAPN10 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CAPN10, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Calpain 10. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CAPN10 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Calpain 10 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Calpain 10 nelle cellule tumorali con espressione di CAPN10 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.