cadherin-20 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401925-ACT

PCDHGB4 codifica la cadherina-20, un membro della famiglia delle protocaderine implicato nell’adesione cellula–cellula calcio-dipendente e nell’organizzazione di complessi di riconoscimento sulla superficie cellulare. Le protocaderine contribuiscono alla definizione del pattern tissutale e al mantenimento dell’architettura cellulare modulando la stabilità delle giunzioni e la segnalazione dipendente dal contatto, con effetti a valle sulla dinamica del citoscheletro e sui programmi di espressione genica. Un’alterata espressione di caderine e protocaderine è stata associata a una disregolazione di adesione, migrazione e stati di differenziamento, aspetti rilevanti per i disturbi dello sviluppo e i processi oncogenici. Nell’ambito della più ampia rete delle caderine, la cadherina-20 è spesso studiata nel contesto della segnalazione mediata dall’adesione e della regolazione trascrizionale specifica di linea cellulare.

cadherin-20 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCDHGB4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cadherin-20 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCDHGB4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCDHGB4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cadherin-20. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCDHGB4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cadherin-20 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cadherin-20 nelle cellule tumorali con espressione di PCDHGB4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.