CA III Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403538-ACT

Il gene umano **CA3** codifica l’anidrasi carbonica III (CA III), una metalloenzima citosolica allo zinco che catalizza l’idratazione reversibile della CO₂ a bicarbonato e protoni, contribuendo al tamponamento del pH intracellulare e al flusso di carbonio. La CA III è altamente espressa nel muscolo scheletrico e in altri tessuti ossidativi, dove si intreccia con l’omeostasi metabolica, l’equilibrio redox e le risposte allo stress ossidativo tramite residui di cisteina reattivi e la S-glutationilazione. Alterazioni dell’espressione di CA3 sono state riportate in contesti di fisiologia muscolare e rimodellamento metabolico, a supporto del suo impiego come indicatore molecolare in studi su miopatie, metabolismo energetico e programmi adattativi allo stress. Come componente della regolazione acido–base mediata dalle anidrasi carboniche, la CA III rappresenta un nodo sperimentale utile per indagare come la dinamica del pH influenzi l’attività enzimatica, la proteostasi e la fitness cellulare.

CA III Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CA3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CA III Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CA3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CA3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CA III. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CA3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CA III nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CA III nelle cellule tumorali con espressione di CA3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.