C7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404773-ACT

Il componente del complemento 7 (C7) codifica una proteina terminale del complemento che si assembla con C5b, C6, C8 e C9 per formare il complesso di attacco alla membrana (MAC), un effettore dell’immunità innata capace di formare pori. Attraverso l’attivazione delle vie del complemento classica, della lectina o alternativa, C7 contribuisce alla lisi dei patogeni, alla rimozione dei complessi immuni e alla modulazione della segnalazione infiammatoria sulle superfici cellulari. Un’attività del complemento disregolata, inclusa un’attivazione anomala della via terminale, è implicata in patologie infiammatorie e autoimmuni ed è stata studiata in contesti quali la suscettibilità alle infezioni e il danno tissutale mediato dal complemento. Oltre alla difesa antimicrobica, la formazione del MAC può influenzare le risposte cellulari allo stress e la produzione di citochine, collegando la biologia di C7 a un’omeostasi immunitaria più ampia.

C7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di C7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus C7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione C7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus C7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C7 nelle cellule tumorali con espressione di C7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.