C3 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-419391-ACT-2

Il componente 3 del complemento del topo (C3) codifica la proteina effettrice centrale del sistema del complemento, la cui attivazione proteolitica in C3a e C3b promuove l’opsonizzazione, la rimozione dei complessi immuni, la chemotassi e l’amplificazione delle risposte immunitarie innate attraverso le vie classica, della lectina e alternativa. La deposizione di C3b favorisce la formazione della convertasi di C5 e interagisce con i recettori del complemento per modulare la fagocitosi e la gestione dell’antigene, collegando l’attività del complemento alla segnalazione infiammatoria e al crosstalk con i programmi di coagulazione e di danno tissutale. Una attivazione disregolata di C3 è implicata in modelli di suscettibilità alle infezioni, patologie autoimmuni e mediate da complessi immuni, neuroinfiammazione e infiammazione metabolica, a testimonianza della sua ampia influenza sulla difesa dell’ospite e sull’immunopatologia. L’editing genetico di C3 nel topo consente studi meccanicistici delle funzioni effettrici dipendenti dal complemento, dell’attivazione specifica di via e dei contributi, risolti per tipo cellulare, all’infiammazione e a fenotipi rilevanti per la malattia in vivo e in sistemi di cellule immunitarie primarie.

C3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di C3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus C3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione C3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus C3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C3 nelle cellule tumorali con espressione di C3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.