C20orf54 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405094-ACT

SLC52A3 codifica C20orf54, un trasportatore di riboflavina (vitamina B2) ad alta affinità che media l’assorbimento cellulare della riboflavina a supporto della biosintesi di FAD e FMN. Regolando la disponibilità dei cofattori flavinici, C20orf54 influenza il metabolismo ossidativo mitocondriale, l’omeostasi redox e le vie dipendenti dalle flavoproteine, inclusi il trasporto degli elettroni e l’ossidazione degli acidi grassi. Alterazioni dell’attività di SLC52A3 sono state associate a deficit di trasporto della riboflavina e a conseguenti disfunzioni metaboliche e neurofisiologiche, rendendolo rilevante per lo studio del trasporto di nutrienti, della bioenergetica mitocondriale e della segnalazione di risposta allo stress.

C20orf54 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC52A3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C20orf54 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC52A3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC52A3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C20orf54. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC52A3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C20orf54 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C20orf54 nelle cellule tumorali con espressione di SLC52A3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.