c-Maf Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-421531-ACT-2

Il gene Maf del topo codifica per il fattore di trascrizione c-Maf, un regolatore basic leucine zipper (bZIP) che si lega agli elementi di riconoscimento MAF per controllare programmi di espressione genica dipendenti dal contesto. c-Maf integra segnali provenienti da vie immunitarie e dello sviluppo per modulare la differenziazione e la funzione cellulare, inclusa la polarizzazione dei linfociti T (in particolare i programmi Th2 e Tfh), gli stati di attivazione dei macrofagi e le reti trascrizionali specifiche di linea in tessuti come il cristallino e le isole pancreatiche. Un’attività deregolata di c-Maf è stata associata ad alterazioni dell’omeostasi immunitaria e a fenotipi infiammatori ed è spesso studiata in modelli di trasformazione linfoide e di disfunzione metabolica o oculare. L’editing genetico di Maf in cellule murine o in topi consente di analizzare in modo meccanicistico l’uso degli enhancer, i circuiti trascrizionali e i marcatori a valle di citochine e di linea, mediante approcci CRISPR di knockout, knock-in o perturbazione regolatoria, accoppiati a RNA-seq, ChIP-seq e profilazione a singola cellula.

c-Maf Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Maf senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

c-Maf Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Maf nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Maf, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di c-Maf. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Maf nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da c-Maf nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via c-Maf nelle cellule tumorali con espressione di Maf silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.