c-Kit Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400106-ACT

Il gene umano **KIT** codifica la tirosin-chinasi recettoriale **c-Kit** (CD117), un recettore di membrana per lo **stem cell factor** che regola sopravvivenza, proliferazione, migrazione e differenziamento nei progenitori ematopoietici, nei melanociti, nelle cellule germinali e nei mastociti. La dimerizzazione indotta dal ligando e l’autofosforilazione attivano le cascate di segnalazione **PI3K–AKT**, **RAS–MAPK**, **JAK/STAT** e **PLCγ**, integrando segnali che controllano l’impegno di linea e l’omeostasi tissutale. Una segnalazione di KIT deregolata è implicata nella trasformazione oncogenica e in un’alterata biologia dei mastociti, e un’attività modificata di c-Kit è associata a tumori e a disturbi ematologici in cui cambiano l’espressione del recettore o l’output di segnalazione.

c-Kit Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KIT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

c-Kit Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KIT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KIT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di c-Kit. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KIT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da c-Kit nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via c-Kit nelle cellule tumorali con espressione di KIT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.