C/EBP α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400195-ACT

CEBPA codifica il fattore di trascrizione C/EBPα, una proteina bZIP (basic leucine zipper) che regola l’impegno di linea e la differenziazione terminale, in particolare nei programmi granulocitici e adipocitici. Legandosi ai motivi CCAAT/enhancer, C/EBPα coordina reti trascrizionali che controllano la restrizione del ciclo cellulare, l’espressione di geni metabolici e la maturazione mieloide, con intersezioni funzionali con le vie di segnalazione delle citochine e con i percorsi di regolazione della cromatina. Un’alterata espressione di CEBPA o sue mutazioni sono frequentemente associate a un’emopoiesi compromessa e a fenotipi di blocco della differenziazione, rendendolo un nodo ampiamente studiato nel controllo trascrizionale dell’identità mieloide. Queste proprietà rendono C/EBPα un modello utile per investigare gli effetti del dosaggio dei fattori di trascrizione, la logica degli enhancer e le transizioni tra stati di differenziazione nelle cellule umane.

C/EBP α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CEBPA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C/EBP α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CEBPA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CEBPA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C/EBP α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CEBPA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C/EBP α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C/EBP α nelle cellule tumorali con espressione di CEBPA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.