BSPII Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402368-ACT

IBSP codifica la sialoproteina ossea II (BSPII), una glicoproteina secreta della matrice extracellulare, altamente acida, arricchita nei tessuti mineralizzati. BSPII si lega all’idrossiapatite e interagisce con le integrine tramite un motivo RGD, sostenendo l’adesione e la migrazione cellulare, nonché il crosstalk tra osteoblasti e osteoclasti durante la deposizione e il rimodellamento della matrice ossea. L’espressione di IBSP è regolata da programmi trascrizionali osteogenici e contribuisce a processi associati alla biomineralizzazione che intersecano le vie di adesione focale e di organizzazione della matrice extracellulare. Un’espressione deregolata di IBSP/BSPII è stata associata ad alterazioni del turnover osseo ed è frequentemente utilizzata come marcatore in studi sullo sviluppo scheletrico, sulla calcificazione e sulle interazioni tra tumore e microambiente osseo.

BSPII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IBSP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BSPII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IBSP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IBSP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BSPII. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IBSP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BSPII nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BSPII nelle cellule tumorali con espressione di IBSP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.