Brn-2/BRN2/POU3F2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422351-ACT

Pou3f2 codifica il fattore di trascrizione a dominio POU Brn-2/BRN2/POU3F2, un regolatore chiave della specificazione e della maturazione della linea neurale nel topo. BRN2 si lega a motivi di DNA di tipo ottamero per coordinare programmi genici che controllano la neurogenesi, la differenziazione neuronale e il mantenimento dell’identità neurale, integrandosi con reti trascrizionali più ampie che modellano l’accessibilità della cromatina e le transizioni di stato cellulare. Durante lo sviluppo e nei tessuti adulti, l’attività di Pou3f2 influenza le linee derivate dalla cresta neurale e del sistema nervoso centrale, collegandola a processi quali la proliferazione dei progenitori, la migrazione e l’espressione di geni sinaptici. Circuiti trascrizionali associati a BRN2 deregolati sono stati studiati in contesti che includono fenotipi neuro-sviluppativi e la plasticità di linea in modelli tumorali, supportandone l’uso come nodo per l’interrogazione di vie e reti geniche.

Brn-2/BRN2/POU3F2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pou3f2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Brn-2/BRN2/POU3F2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pou3f2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pou3f2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Brn-2/BRN2/POU3F2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pou3f2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Brn-2/BRN2/POU3F2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Brn-2/BRN2/POU3F2 nelle cellule tumorali con espressione di Pou3f2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.