BRCA1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419362-ACT

Il gene murino Brca1 codifica la proteina oncosoppressore BRCA1, un regolatore centrale della stabilità del genoma che coordina la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA, la protezione della forcella di replicazione e il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare. BRCA1 agisce nella ricombinazione omologa attraverso interazioni con partner quali BARD1, PALB2 e RAD51, e modula la cromatina e la segnalazione mediata dall’ubiquitina nei siti di danno. Nelle cellule dei mammiferi, BRCA1 integra le risposte al danno del DNA dipendenti da ATM/ATR con i programmi trascrizionali e di replicazione per limitare la mutagenesi. L’alterazione o la disregolazione delle vie legate a BRCA1 è ampiamente utilizzata come modello per studiare i meccanismi di instabilità genomica, le risposte allo stress e i difetti di riparazione del DNA rilevanti per il cancro nella ricerca biomedica.

BRCA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Brca1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BRCA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Brca1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Brca1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BRCA1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Brca1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BRCA1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BRCA1 nelle cellule tumorali con espressione di Brca1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.