BRAK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404185-ACT

CXCL14 kodiert das Chemokin BRAK, einen sezernierten Liganden der CXC-Familie, der an der Regulation des Leukozyten-Traffickings beteiligt ist und die lokale Zusammensetzung von Immunzellen in epithelialen und stromalen Mikroumgebungen prägt. Die BRAK-Signalgebung beeinflusst Chemotaxis, Zell-Zell-Kommunikation und Gewebehomöostase, mit nachgelagerten Effekten auf Entzündungsprogramme, das angiogene Gleichgewicht und stromales Remodeling. Eine veränderte CXCL14-Expression wurde in mehreren Krankheitskontexten beschrieben, darunter entzündungsassoziierte Gewebedysfunktionen und verschiedene Malignome, wo sie im Hinblick auf ihre Auswirkungen auf Tumor-Immun-Interaktionen, invasionsassoziierte Veränderungen der Mikroumgebung und epitheliale Differenzierungszustände untersucht wird.

BRAK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CXCL14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BRAK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CXCL14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CXCL14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BRAK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CXCL14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BRAK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BRAK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CXCL14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.