BRAK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404185-ACT

CXCL14 codifica la chemochina BRAK, un ligando secreto della famiglia CXC coinvolto nella regolazione del traffico leucocitario e nel modellare la composizione locale delle cellule immunitarie in microambienti epiteliali e stromali. La segnalazione di BRAK influenza la chemotassi, la comunicazione cellula–cellula e l’omeostasi tissutale, con effetti a valle sui programmi infiammatori, sull’equilibrio angiogenico e sul rimodellamento dello stroma. Alterazioni dell’espressione di CXCL14 sono state riportate in molteplici contesti patologici, inclusi la disfunzione tissutale associata all’infiammazione e varie neoplasie, dove viene studiata per il suo impatto sulle interazioni tumore–sistema immunitario, sui cambiamenti del microambiente associati all’invasione e sugli stati di differenziamento epiteliale.

BRAK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CXCL14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BRAK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CXCL14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CXCL14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BRAK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CXCL14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BRAK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BRAK nelle cellule tumorali con espressione di CXCL14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.