brachyury Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416539-ACT

Il gene T umano codifica brachyury, un fattore di trascrizione della famiglia T-box essenziale per la specificazione del mesoderma, la formazione della notocorda e lo sviluppo dell’asse posteriore. Brachyury regola i programmi di linea cellulare legandosi a motivi T-box e coordinando reti trascrizionali che interagiscono con processi associati all’EMT, la migrazione cellulare e vie di patterning dello sviluppo. In contesti adulti, una deregolazione dell’espressione di T è stata collegata a stati di differenziazione alterati e a riprogrammazione trascrizionale osservati in molteplici tipi tumorali e nel cordoma, dove brachyury è spesso studiato come marcatore associato alla linea e come driver. In quanto regolatore dello sviluppo, brachyury rappresenta un nodo accessibile per interrogare i circuiti di regolazione genica che controllano le transizioni epitelio–mesenchimali e le decisioni di destino mesodermico in modelli cellulari umani.

brachyury Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di T senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

brachyury Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus T nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione T, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di brachyury. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus T nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da brachyury nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via brachyury nelle cellule tumorali con espressione di T silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.