BNIP-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400985-ACT

BNIP3 codifica BNIP-3, una proteina BH3-only inducibile dall’ipossia che si localizza nei mitocondri e regola il controllo di qualità mitocondriale, la mitofagia e le decisioni di morte cellulare. Attraverso interazioni con i membri della famiglia BCL2 e con il macchinario dell’autofagia, BNIP-3 collega il rilevamento dell’ossigeno al rimodellamento della membrana mitocondriale, all’adattamento metabolico e all’apoptosi responsiva allo stress oppure alla rimozione autofagica. BNIP-3 è controllata a livello trascrizionale da vie di segnalazione dell’ipossia come HIF-1 e partecipa alle risposte cellulari a ischemia, deprivazione di nutrienti e stress ossidativo. Un’espressione deregolata di BNIP3 è stata associata ad alterazioni della biologia dell’ipossia tumorale, alle risposte allo stress dei cardiomiociti e a processi neurodegenerativi in cui la disfunzione mitocondriale e la mitofagia compromessa contribuiscono alla patologia.

BNIP-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BNIP3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BNIP-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BNIP3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BNIP3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BNIP-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BNIP3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BNIP-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BNIP-3 nelle cellule tumorali con espressione di BNIP3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.