betaKlotho Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401614-ACT

Il gene umano **KLB** codifica **betaKlotho**, un co-recettore transmembrana a singolo passaggio che conferisce specificità di ligando alla segnalazione delle FGF endocrine, facilitando in particolare la segnalazione **FGF19/FGFR4** negli epatociti e **FGF21/FGFR1c** nei tessuti metabolici. Attraverso queste vie, betaKlotho regola l’omeostasi degli acidi biliari, il metabolismo del glucosio e dei lipidi e l’equilibrio energetico, modulando i programmi trascrizionali a valle della via **MAPK/ERK** e di vie correlate. Un’alterata espressione o funzione di KLB è stata associata a disfunzioni metaboliche, tra cui obesità, insulino-resistenza e processi legati alla steatosi epatica non alcolica, e può influenzare la crescita epatica e le risposte allo stress. Poiché KLB è un determinante chiave della responsività alle FGF endocrine, viene spesso studiato in modelli di sensing dei nutrienti, segnalazione degli epatociti e crosstalk tra tessuto adiposo e fegato.

betaKlotho Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KLB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

betaKlotho Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KLB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KLB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di betaKlotho. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KLB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da betaKlotho nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via betaKlotho nelle cellule tumorali con espressione di KLB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.