beta-catenin Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419477-ACT

Ctnnb1 codifica la beta-catenina, una proteina multifunzionale con ripetizioni armadillo che collega le giunzioni aderenti basate sulle caderine al citoscheletro di actina e funge da co-attivatore trascrizionale centrale nella segnalazione canonica Wnt. In seguito all’attivazione della via Wnt, la beta-catenina stabilizzata si accumula nel nucleo e si associa ai fattori TCF/LEF per regolare programmi genici che controllano proliferazione, differenziamento, dinamiche epitelio-mesenchimali e mantenimento delle cellule staminali. Una regolazione rigorosa del turnover della beta-catenina da parte del complesso di degradazione APC/AXIN/GSK3β è essenziale per l’omeostasi tissutale, e l’alterazione di questo asse è fortemente associata a segnalazione oncogenica. Nei modelli murini, la perturbazione di Ctnnb1 è ampiamente utilizzata per studiare sviluppo, rigenerazione e reti di segnalazione rilevanti per la malattia in intestino, fegato, cute, osso e compartimenti immunitari.

beta-catenin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ctnnb1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

beta-catenin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ctnnb1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ctnnb1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di beta-catenin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ctnnb1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da beta-catenin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via beta-catenin nelle cellule tumorali con espressione di Ctnnb1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.