Bag-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404540-ACT

BAG2 (Bag-2) codifica un co-chaperone che si lega a Hsp70/Hsc70 e interagisce con il sistema ubiquitina–proteasoma per regolare il ripiegamento, la selezione (triage) e il turnover delle proteine client. Modulando l’attività delle chaperoni e la proteostasi, BAG2 influenza le risposte cellulari allo stress, il controllo qualità delle proteine e la stabilità delle proteine di segnalazione in condizioni basali e di stress. Un’espressione o una funzione deregolata di BAG2 è stata associata a fenotipi di aggregazione proteica e a un’alterazione dei segnali di sopravvivenza implicati nella neurodegenerazione e nella biologia del cancro. Queste proprietà rendono BAG2 un nodo utile per analizzare le vie mediate dalle chaperoni, lo stress proteotossico e i meccanismi che modellano l’omeostasi proteica nelle cellule umane.

Bag-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BAG2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Bag-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BAG2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BAG2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Bag-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BAG2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Bag-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Bag-2 nelle cellule tumorali con espressione di BAG2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.