ATR Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-400335-LAC

ATR (ataxia telangiectasia and Rad3-related) codifica una chinasi serina/treonina di tipo PI3K-like che funge da sensore centrale dello stress replicativo e del DNA a singolo filamento, attivando la segnalazione dei checkpoint per preservare la stabilità del genoma. ATR viene reclutata tramite ATRIP e stimolata da TOPBP1 ed ETAA1 a fosforilare substrati chiave come CHK1, coordinando la progressione della fase S, la stabilizzazione delle forcelle di replicazione e la scelta delle vie di riparazione del DNA. Attraverso il crosstalk con i fattori della ricombinazione omologa e i complessi di protezione della forcella, la segnalazione di ATR limita le rotture a doppio filamento associate alla replicazione e controlla l’arresto del ciclo cellulare in condizioni di stress genotossico. Un’attività deregolata della via di ATR è associata a instabilità cromosomica ed è spesso studiata nel contesto della biologia del cancro, dei disturbi del neurosviluppo e delle sindromi che comportano un’alterata risposta al danno al DNA.

Le particelle di attivazione lentivirale ATR (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di ATR in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale ATR (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione ATR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di ATR. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo ATR e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.