ATP7A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402387-ACT

ATP7A codifica una ATPasi di tipo P trasportatrice di rame che regola la distribuzione intracellulare del rame esportandolo dal citosol e convogliandolo nella via secretoria per la metallazione degli enzimi rame-dipendenti (cuproenzimi). Controllando l’efflusso e il traffico del rame, ATP7A sostiene l’omeostasi redox, le risposte mitocondriali e allo stress ossidativo, nonché la maturazione enzimatica all’interno della rete del Golgi. Un’attività di ATP7A deregolata altera l’equilibrio del rame e influisce su processi quali la formazione del tessuto connettivo e la segnalazione neuro-sviluppativa, attraverso una compromissione della funzione dei cuproenzimi. Di conseguenza, ATP7A è ampiamente studiato in modelli di disturbi del metabolismo del rame e in vie di stress cellulare legate all’attività enzimatica rame-dipendente.

ATP7A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP7A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ATP7A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP7A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP7A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ATP7A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP7A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ATP7A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ATP7A nelle cellule tumorali con espressione di ATP7A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.