ATP6V0E1 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-411234-LAC

ATP6V0E1 codifica la subunità E1 del dominio V0 della V-ATPasi, un componente fondamentale della H\+-ATPasi vacuolare che accoppia l’idrolisi dell’ATP alla traslocazione di protoni attraverso i sistemi endomembranosi. Acidificando endosomi, lisosomi e vescicole secretorie, ATP6V0E1 supporta l’endocitosi mediata da recettori, l’attività delle idrolasi lisosomiali, il turnover proteico e l’autofagia, e contribuisce al traffico dipendente dal pH all’interno della rete Golgi–endosomiale. La funzione della V-ATPasi si integra inoltre con vie di sensing dei nutrienti e di proteostasi, inclusa la regolazione di mTORC1 sulla superficie lisosomiale e risposte allo stress legate all’equilibrio acido-base degli organelli. Una acidificazione vescicolare deregolata e alterazioni delle subunità della V-ATPasi sono associate a fenotipi cellulari rilevanti per la neurodegenerazione, il metabolismo e l’invasività delle cellule tumorali e la segnalazione immunitaria che dipende dal processamento endolisosomiale.

Le particelle di attivazione lentivirale ATP6V0E1 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di ATP6V0E1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale ATP6V0E1 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione ATP6V0E1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di ATP6V0E1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo ATP6V0E1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.