ATP6E Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404046-ACT

ATP6V1E1 umano codifica la subunità E1 (ATP6E) del dominio periferico V1 della H+-ATPasi vacuolare (V-ATPasi), una pompa protonica multisubunità che guida l’acidificazione ATP-dipendente di endosomi, lisosomi, Golgi e vescicole secretorie. Regolando il pH degli organelli, la V-ATPasi supporta l’endocitosi mediata da recettori, il flusso autofagia–lisosoma, la proteostasi e le vie di sensing dei nutrienti, incluso il segnale di mTORC1 sulla superficie lisosomiale. L’acidificazione dipendente da ATP6V1E1 influenza anche il processamento degli antigeni, il traffico di membrana e l’attività di enzimi sensibili al pH, collegando il gene a meccanismi fondamentali di omeostasi cellulare. Una funzione deregolata della V-ATPasi è associata ad alterazioni del traffico vescicolare e a disfunzione lisosomiale osservate in una gamma di fenotipi cellulari rilevanti per diverse patologie, inclusi contesti di neurosviluppo e stress metabolico.

ATP6E Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP6V1E1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ATP6E Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP6V1E1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP6V1E1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ATP6E. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP6V1E1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ATP6E nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ATP6E nelle cellule tumorali con espressione di ATP6V1E1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.