ATP11B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411692-ACT

ATP11B codifica una flippasi di fosfolipidi P4-ATPasi che aiuta a mantenere l’asimmetria lipidica della membrana plasmatica e delle endomembrane, traslocando aminofosfolipidi attraverso i doppi strati in modo dipendente dall’ATP. Attraverso la regolazione della curvatura di membrana e della composizione dei foglietti, ATP11B contribuisce alla gemmazione delle vescicole, al riciclo endocitico e ai processi di traffico associati al Golgi che modellano lo smistamento proteico e la polarità cellulare. Un trasporto fosfolipidico alterato e dinamiche di membrana che coinvolgono ATP11B sono stati collegati in letteratura a cambiamenti nei fenotipi di trasporto dei farmaci e nelle risposte allo stress in modelli di cellule tumorali, a supporto dell’indagine sui meccanismi di chemioresistenza e sul traffico intracellulare. La sua attività interseca anche vie che controllano l’omeostasi di membrana, la segnalazione dell’apoptosi legata allo scrambling lipidico e la funzione degli organelli.

ATP11B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP11B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ATP11B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP11B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP11B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ATP11B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP11B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ATP11B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ATP11B nelle cellule tumorali con espressione di ATP11B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.