Atg12 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401894-ACT

Humanes **ATG12** kodiert **Atg12**, einen ubiquitinähnlichen Modifikator, der für die Autophagie essenziell ist, indem er kovalent an **ATG5** konjugiert wird und so den **ATG12–ATG5–ATG16L1**-Komplex bildet, der die Expansion des Phagophors und die Biogenese von Autophagosomen antreibt. Diese Maschinerie unterstützt die basale Proteostase und die Anpassung an Stress, indem sie den lysosomalen Abbau geschädigter Organellen und aggregierter Proteine ermöglicht, und sie greift dabei in nährstoffsensorische Signalwege wie **mTOR** und **AMPK** ein. Störungen des durch **ATG12** regulierten autophagischen Flusses wurden mit veränderter inflammatorischer Signalgebung, beeinträchtigter zellulärer Homöostase sowie kontextabhängigen Rollen in der Tumorbiologie und bei neurodegenerationsassoziiertem proteotoxischem Stress in Verbindung gebracht. Als zentrale Autophagiekomponente wird **ATG12** häufig genutzt, um das Crosstalk zwischen Organellen-Qualitätskontrolle, angeborenen Immunantworten und metabolischer Umprogrammierung zu untersuchen.

Atg12 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATG12-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Atg12 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATG12-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATG12-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Atg12-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATG12-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Atg12-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Atg12-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATG12-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.