Atg12 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401894-ACT

ATG12 umano codifica Atg12, un modificatore ubiquitina-simile essenziale per l’autofagia tramite la sua coniugazione covalente con ATG5, formando il complesso ATG12–ATG5–ATG16L1 che guida l’espansione del fagoforo e la biogenesi dell’autofagosoma. Questo macchinario sostiene la proteostasi basale e l’adattamento allo stress consentendo il turnover lisosomiale di organelli danneggiati e proteine aggregate, intersecandosi con vie di rilevamento dei nutrienti come mTOR e AMPK. L’alterazione del flusso autofagico regolato da ATG12 è stata collegata a segnali infiammatori modificati, a un’omeostasi cellulare compromessa e a ruoli dipendenti dal contesto nella biologia tumorale e nello stress proteotossico associato alla neurodegenerazione. In quanto componente centrale dell’autofagia, ATG12 è ampiamente utilizzato per studiare il crosstalk tra controllo qualità degli organelli, risposte immunitarie innate e rimodellamento metabolico.

Atg12 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATG12 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Atg12 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATG12 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATG12, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Atg12. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATG12 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Atg12 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Atg12 nelle cellule tumorali con espressione di ATG12 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.