ASM Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423033-ACT

Il gene murino **Smpd1** codifica la sfingomielinasi acida (ASM), un’idrolasi lisosomiale che converte la sfingomielina in ceramide e fosforilcolina, regolando così il turnover degli sfingolipidi e il rimodellamento delle membrane. La produzione di ceramide dipendente da ASM influenza la funzione endolisosomiale, il dialogo tra autofagia e lisosoma e vie di segnalazione sensibili allo stress collegate a infiammazione e morte cellulare. L’alterazione dell’attività di ASM compromette l’omeostasi lipidica e favorisce l’accumulo di sfingomielina, un segno distintivo delle patologie da accumulo lisosomiale e di una funzione alterata della mielina e delle cellule immunitarie. Nella ricerca biomedica, Smpd1/ASM viene utilizzato per studiare la biologia dei lisosomi, la segnalazione mediata dalla ceramide e i meccanismi che collegano il metabolismo lipidico alla neurodegenerazione e allo stress metabolico.

ASM Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Smpd1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ASM Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Smpd1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Smpd1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ASM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Smpd1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ASM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ASM nelle cellule tumorali con espressione di Smpd1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.