ASM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401347-ACT

L’SMPD1 umano codifica la sfingomielinasi acida (ASM), un’idrolasi lisosomiale che scinde la sfingomielina generando ceramide e fosforilcolina, regolando così l’omeostasi degli sfingolipidi. L’attività dell’ASM influenza l’organizzazione dei microdomini di membrana, il traffico endolisosomiale e le vie di segnalazione attivate dallo stress, collegate ad apoptosi ceramide-dipendente, autofagia e risposte infiammatorie. L’alterazione di SMPD1 modifica la funzione lisosomiale e le dinamiche di accumulo lipidico, con una rilevanza ben consolidata per le malattie da deposito di sfingolipidi e per meccanismi più ampi di neurodegenerazione e disregolazione immunitaria. In quanto nodo centrale del metabolismo sfingomielina–ceramide, SMPD1 è spesso studiato per il suo impatto sull’adattamento cellulare allo stress e sulla segnalazione associata alla membrana.

ASM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMPD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ASM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMPD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMPD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ASM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMPD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ASM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ASM nelle cellule tumorali con espressione di SMPD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.