ASCL1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421562-ACT

Ascl1 codifica il fattore di trascrizione bHLH della famiglia achaete-scute nel topo, ASCL1, un regolatore proneurale che promuove l’impegno di linea neuronale e la differenziazione. ASCL1 coordina programmi di espressione genica che controllano l’uscita dal ciclo cellulare, la maturazione dei progenitori neurali e la crescita dei neuriti tramite reti trascrizionali dipendenti da bHLH/E-box e il rimodellamento della cromatina. Nei modelli di sviluppo e di malattia, un’alterata attività di ASCL1 è associata a neurogenesi compromessa e plasticità di linea, ed è spesso studiato in contesti in cui lo stato di differenziazione neuronale influenza il comportamento cellulare. Queste proprietà rendono ASCL1 un nodo centrale per investigare le vie di sviluppo neurale e i circuiti trascrizionali nei sistemi murini.

ASCL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ascl1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ASCL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ascl1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ascl1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ASCL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ascl1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ASCL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ASCL1 nelle cellule tumorali con espressione di Ascl1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.