ASB-2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-425766-ACT

Il gene murino Asb2 codifica ASB-2, una subunità di riconoscimento del substrato contenente un dominio SOCS box dei complessi E3 ubiquitin ligasi Cullin5/Rbx2, che contribuisce a indirizzare proteine specifiche verso l’ubiquitinazione e la successiva degradazione proteasomiale. ASB-2 è implicata nella regolazione dei programmi di differenziamento ematopoietico e mieloide, modulando la stabilità di effettori di segnalazione e trascrizionali che controllano l’impegno di linea e la maturazione cellulare. Attraverso la proteostasi dipendente dall’ubiquitina, ASB-2 contribuisce a vie che governano la progressione del ciclo cellulare, la differenziazione e le risposte allo stress. Un’attività disregolata di ASB-2 e un’alterazione dell’equilibrio delle ubiquitin ligasi sono di ampia rilevanza per studi sui meccanismi delle malattie ematologiche, sugli stati infiammatori e sulla biologia del cancro, in cui le reti di degradazione proteica influenzano il destino cellulare.

ASB-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Asb2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ASB-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Asb2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Asb2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ASB-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Asb2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ASB-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ASB-2 nelle cellule tumorali con espressione di Asb2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.