ARX Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402055-ACT

ARX (aristaless related homeobox) codifica un fattore di trascrizione homeobox che regola programmi di espressione genica necessari per la proliferazione dei progenitori neurali, la differenziazione degli interneuroni e la definizione dei pattern regionali durante lo sviluppo del prosencefalo. Attraverso il legame al DNA in modo sequenza-specifico e l’interazione con complessi co-regolatori, ARX coordina reti trascrizionali che influenzano la migrazione e la maturazione neuronale. Un’attività di ARX deregolata è associata a disturbi del neurosviluppo, inclusi la disabilità intellettiva legata al cromosoma X e fenotipi associati all’epilessia, rendendolo un bersaglio frequente negli studi sulla regolazione genica dello sviluppo. Nei modelli cellulari umani, ARX rappresenta un nodo sperimentalmente maneggevole per analizzare come dosaggio e tempistica dei fattori di trascrizione plasmino le decisioni di destino di linea.

ARX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARX senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARX nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARX, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARX. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARX nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARX nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARX nelle cellule tumorali con espressione di ARX silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.