ARP-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405241-ACT

NR2F2 codifica per il recettore nucleare orfano umano ARP-1 (COUP-TFII), un fattore di trascrizione indipendente dal ligando che si lega agli elementi di risposta ormonale per coordinare programmi genici che controllano il destino cellulare, l’angiogenesi e l’adattamento metabolico. ARP-1 si integra con la segnalazione dei recettori nucleari e con le reti di regolazione della cromatina per modulare il patterning dello sviluppo, le transizioni epitelio–mesenchimali e la specificazione vascolare. Un’espressione deregolata di NR2F2 è stata associata a stati di differenziamento alterati e a riprogrammazione trascrizionale osservati in fenotipi cardiovascolari congeniti e in molteplici vie rilevanti per il cancro. Nei modelli cellulari, ARP-1 è comunemente studiato per i suoi ruoli nella selezione degli enhancer, nei circuiti trascrizionali specifici di linea e nel cross-talk con le vie dei recettori steroidei e dei retinoidi.

ARP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NR2F2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NR2F2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NR2F2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARP-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NR2F2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARP-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARP-1 nelle cellule tumorali con espressione di NR2F2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.