Plasmide CRISPR d'Activation (h) Arkadia: sc-403319-ACT

Le gène humain RNF111 code Arkadia, une ligase E3 de type RING qui module la signalisation de la superfamille du TGF-β en ubiquitinylant des composants régulateurs et en façonnant l’amplitude ainsi que la durée de la transcription dépendante des SMAD. Par le biais de la protéostasie médiée par l’ubiquitine, Arkadia influence des sorties de signalisation nucléaire qui gouvernent les décisions de destin cellulaire, les programmes de différenciation et le contrôle de la croissance dépendant du contexte. L’activité de RNF111 s’entrecroise avec des voies contrôlant la régulation transcriptionnelle et le renouvellement des protéines, ce qui la rend pertinente pour l’étude de la biologie du développement et de la plasticité cellulaire. Une signalisation TGF-β/SMAD dérégulée et des dynamiques altérées de la voie de l’ubiquitine liées à RNF111 ont été associées, dans plusieurs systèmes modèles, à des remaniements pathologiques et à des états de signalisation associés aux tumeurs.

Arkadia Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RNF111 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Arkadia Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RNF111 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RNF111, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Arkadia. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RNF111 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Arkadia au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Arkadia dans les cellules tumorales présentant une expression de RNF111 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.