Arc Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400231-ACT

ARC codifica la proteina associata al citoscheletro regolata dall’attività (Arc), prodotto di un gene a espressione immediata (immediate-early) che collega l’attività neuronale al rimodellamento sinaptico. Arc regola l’endocitosi dei recettori AMPA, la dinamica del citoscheletro di actina e la traduzione locale nelle spine dendritiche, contribuendo così a modulare la plasticità sinaptica, l’apprendimento e la memoria. Attraverso queste funzioni, si integra con vie di segnalazione dipendenti dall’attività e con programmi omeostatici di “synaptic scaling” che regolano finemente la neurotrasmissione eccitatoria. Un’espressione disfunzionale di ARC o un traffico dipendente da Arc sono stati implicati in contesti di ricerca neuropsichiatrica e neurodegenerativa, inclusi studi su disfunzioni cognitive, suscettibilità alle crisi epilettiche e alterazioni della densità sinaptica.

Arc Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Arc Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Arc. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Arc nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Arc nelle cellule tumorali con espressione di ARC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.