APOBEC3B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401700-ACT

APOBEC3B codifica una deaminasi della citidina che modifica il DNA a singolo filamento convertendo la citosina in uracile, svolgendo un ruolo nella difesa antivirale intrinseca e nella restrizione dei retroelementi. La sua attività interagisce con i processi di replicazione e riparazione del DNA, incluse le risposte allo stress replicativo e l’elaborazione di lesioni mutagene, contribuendo così a plasmare i pattern di mutazione a livello dell’intero genoma. Un’espressione deregolata di APOBEC3B è associata a un aumento del carico mutazionale somatico e a caratteristiche firme mutazionali di tipo APOBEC in molteplici tipi di tumore. Di conseguenza, APOBEC3B è ampiamente studiato nei pathway che controllano la stabilità del genoma, la segnalazione dell’immunità innata e l’adattamento guidato dalle mutazioni.

APOBEC3B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di APOBEC3B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

APOBEC3B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus APOBEC3B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione APOBEC3B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di APOBEC3B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus APOBEC3B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da APOBEC3B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via APOBEC3B nelle cellule tumorali con espressione di APOBEC3B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.