APC1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405103-ACT

ANAPC1 umano codifica APC1, una subunità strutturale centrale (scaffold) del complesso promotore dell’anafase/ciclosoma (APC/C), un’essenziale ligasi E3 dell’ubiquitina che coordina una proteolisi ordinata durante la mitosi e la fase G1. Attraverso le interazioni dell’APC/C con co-attivatori come CDC20 e CDH1, APC1 sostiene l’ubiquitinazione e la degradazione di regolatori chiave del ciclo cellulare, garantendo così il controllo del checkpoint del fuso, l’uscita dalla mitosi e la stabilità del genoma. La deregolazione dell’attività dell’APC/C e delle vie correlate ubiquitina–proteasoma è associata a instabilità cromosomica e a segnali proliferativi alterati, rendendo ANAPC1 un nodo rilevante per studi sul controllo del ciclo cellulare e su fenotipi associati al cancro.

APC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ANAPC1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

APC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ANAPC1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ANAPC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di APC1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ANAPC1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da APC1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via APC1 nelle cellule tumorali con espressione di ANAPC1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.