ANT2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400680-ACT

SLC25A5 codifica per la traslocasi dei nucleotidi adenilici 2 (ANT2), un trasportatore della membrana interna mitocondriale che scambia l’ADP citosolico con l’ATP della matrice, accoppiando la fosforilazione ossidativa alla richiesta energetica cellulare. Regolando il flusso di nucleotidi adenilici e il potenziale di membrana mitocondriale, ANT2 influenza l’omeostasi bioenergetica, l’equilibrio redox e la suscettibilità a risposte allo stress associate alla transizione di permeabilità mitocondriale. L’attività di ANT2 è collegata alla riprogrammazione metabolica e a stati proliferativi, e la sua espressione alterata è stata studiata nel contesto del metabolismo tumorale e di altri disturbi caratterizzati da disfunzione mitocondriale. In quanto trasportatore della famiglia SLC legato al cromosoma X, SLC25A5 è rilevante anche per studi sull’utilizzo energetico tessuto-specifico e sulla segnalazione compensatoria tra le diverse isoforme di ANT.

ANT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC25A5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ANT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC25A5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC25A5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ANT2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC25A5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ANT2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ANT2 nelle cellule tumorali con espressione di SLC25A5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.